新技术、新应用，水产动物病原快速检测又出新招

　　水产养殖是我国的传统优势产业，目前已成为我国农业经济的重要组成部分。然而，近年来随着水产养殖密度的增加，鱼类病害不断增多，造成了巨大的经济损失。因此，建立有效、准确和快速的水产动物病原检测技术是当前及今后一段时间内，迫切需要解决的问题。本文主要介绍了近年来出现的一些水产动物病原快速检测技术，以期为有效防治水产动物疾病提供参考。

　　荧光定量PCR检测

　　荧光定量PCR（Q-PCR）是指通过实时荧光定量PCR仪对目的基因进行定量检测的一种方法。目前，已有许多公司开发出了基于荧光定量PCR的快速检测技术，如基础的染料法、TaqMan探针法、循环阈值（Ct值）法、多重荧光定量PCR等。荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性强等优点，且无需对PCR产物进行扩增和检测，因此成为基因编辑技术应用于病原检测最常用的方法之一。

　　近年来，荧光定量PCR检测方法被广泛应用于各种生物及环境样品中病原菌的检测。但是该技术也存在一定的局限性，如荧光定量PCR需要预先进行引物设计和扩增条件优化；荧光定量PCR检测需经过严格的质控和人工操作程序；对外源DNA或RNA进行定量时，需要通过多重PCR等方式来提高扩增效率等。

　　纳米材料检测

　　纳米材料的应用主要集中在生物医学领域，如纳米银、纳米氧化铁等。利用这些纳米材料检测水产动物病原，具有快速、准确和灵敏等优点，利用纳米材料作为生物识别元件进行免疫分析也是目前研究的热点之一。有学者利用开发了一种基于针对神经坏死病毒（NNV）的抗体金纳米颗粒的侧流免疫层析条带试验，用于快速、现场检测病毒。先是将一种抗NNV的单克隆抗体与胶体金偶联作为检测器抗体。将兔抗NNV多克隆抗体和山羊抗小鼠IgG抗体分别在硝化纤维素膜上作为捕获抗体在硝化纤维素膜上，然后此试纸条在15min内眼睛可见反应，与其他病毒未发生交叉反应。条带检测限约为103TCID50/ml，在4°C保存8个月后稳定性良好。

　　基因编辑检测

　　基因编辑检测技术是通过对病原体相关基因进行定点、靶向编辑，从而使病原体丧失致病性。在基因编辑技术中，CRISPR/Cas9系统因其具有高通量、高效性、专一性等特点而备受关注。目前，国内外学者已经成功将CRISPR/Cas9系统应用于多种细菌、病毒等病原体的基因编辑，包括嗜水气单胞菌、沙门氏菌、肠道病毒71型以及嗜酸性肉芽肿病毒等。CRISPR/Cas9技术是一种以“基因打靶”为原理的基因编辑技术，通过在外源DNA或RNA上设计和添加Cas9蛋白DNA或RNA引导序列，对特定基因进行定点敲除或敲入，从而达到所需目的。该技术具有操作简便、安全性高等特点，可有效用于水产动物病原菌的检测。通过将CRISPR/Cas9基因编辑系统与荧光定量PCR技术结合，可以构建出一种新型的水产品病原快速检测方法。该方法通过对外源DNA或RNA进行定点、定向编辑，从而实现快速、准确的病原检测。相比于传统荧光定量PCR检测方法，该方法具有以下优点：（1）对病原菌的特异性更强；（2）缩短了病原检测时间；（3）不需要任何复杂的实验室条件；（4）所需时间短，不需要专业的操作人员等。

　　由于病原检测技术的不断发展，传统病原检测方法越来越不能满足实际生产中的需要，所以需要将分子生物学、微生物学、免疫学等技术与病原检测技术相结合，逐渐成为一种新型的病原检测方法。同时，随着水产养殖病害问题日益突出，病害防控中越来越重视病原检测技术的应用，使得各种新型病原检测技术在水产动物养殖过程中得到了广泛应用。在实际应用中根据具体情况选择合适的病原检测技术，能提高水产动物疾病防控水平和水产养殖产量。

　　作者：杨祎（大连海洋大学水产与生命学院研究生）

　　科学性审核：刘鹰（浙江大学生物系统工程与食品科学学院博士生导师）、刘鹏飞（大连海洋大学海洋科技与环境学院研究生导师）

　　策划：刘雅丹 武玥彤

　　校对：王嘉伟（实习）